摘要：目的考察辛味中药挥发油的“四气”药性、透皮促渗能力和化学成分的关联性。方法选择不同“四气”药性的20味辛味挥发油开展配对比较，采用水蒸气蒸馏提取、GC-MS分析成分后，通过皮肤电阻动力学技术考察其透皮促渗能力，根据研究结果运用逐步判别法和方差分析法遴选因子并建立预测模型。结果中药挥发油透皮促渗能力排序为热性＞温性＞寒凉。倍半萜类化合物含量越高药性趋于温热性，促渗能力越大。相反，不含倍半萜类化合物或者含量少，药性趋于寒凉性，促渗能力较小。结论辛味中药挥发油的透皮促渗能力存在“四气”药性-成分类别-促渗能力的关联性，挥发油所含的倍半萜类成分可能是和“四气”药性及促渗能力相关性最大的化学成分。

中医讲究“内外兼治”，经皮给药是中药除口服以外最常用的给药途径之一，迄今已经有两千多年的应用历史。但是，由于皮肤屏障功能较强，大部分药物成分都很难通过，为了改善吸收，最常用的方法就是应用透皮吸收促进剂（penetrationenhancers，PE）。

中药挥发油是一大类性质优良的PE[1-2]。课题组前期研究发现中药挥发油PE均来自辛味中药[3]，符合中医理论对辛味的认识，例如“辛入肺，肺在体合皮”“辛从金化，水之母也，其能开腠理致津液者，以辛能通气也”。在此基础上提出了基于药性特征的中药挥发油PE研究方法[4]。

“四气”是中药的核心药性特征，本实验选择了20种辛味中药挥发油，并且两两配对，配对比较的2种中药挥发油均来自同一类中药（温里药、解表药、活血化瘀药或理气药），除四气药性不同外，其他药性特征（如五味、归经）和挥发油的药理作用基本相同。配对比较的目的是通过数据挖掘技术阐明四气药性（热和温、温和寒凉）对辛味中药挥发油透皮促渗能力的影响，并进而探讨导致这一影响的物质基础。

1材料与方法

1.1仪器

PTHW型调温电热套（南通市通州申通电热器厂），挥发油提取器（南京南奥科技有限公司），TGL-16B型高速离心机（上海安亭科学仪器厂），BAS-S型分析天平、BT-52S型分析天平（德国赛多利斯股份有限公司），Millicell-ERS02型细胞膜电阻测定仪（美国Millipore公司），AgilentA-C型气相色谱质谱联用仪（美国安捷伦公司）。

1.2药物与试剂

中药饮片高良姜、干姜、防风、柴胡（根）、花椒、八角茴香、小茴香、胡椒、荜澄茄、吴茱萸、荆芥、肉桂、丁香、青木香、木香、郁金、藁本均购自于苏州市天灵中药饮片有限公司，批号分别为、、、、、、、、、、、、、、、、；乳香购自北京仟草中药饮片有限公司，批号，上述中药饮片经南京中医药大学刘圣金副教授鉴定均符合《中国药典》年版一部要求；薄荷油（购自黄山天目薄荷药业有限公司，批号）。异丙醇、醋酸乙酯均购自永华化学科技（江苏）有限公司，批号分别为、。

1.3动物

雄性SD大鼠，体质量（±20）g，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号SCXK（苏）-。

1.4中药挥发油的制备

除薄荷油直接购置外，其余19种中药挥发油提取方法如下：称取一定质量的饮片，粉碎至一定粒度，加入适当的圆底烧瓶中，加入一定倍数的蒸馏水，连接挥发油提取器、冷凝管，自冷凝管上端加蒸馏水至溢出挥发油提取器支口。浸泡一定时间，加热保持微沸一定时间，至挥发油的量不再增加时，停止加热。室温下放置1h，用棕色玻璃瓶接收挥发油，加入适量无水硫酸钠脱水，4℃下避光密封保存备用。具体条件见表1。

1.5中药挥发油的GC-MS分析

1.5.1供试品制备取各挥发油0.10g，精密称定，置于10mL量瓶中，加醋酸乙酯稀释定容至刻度。取适量r/min离心10min，取上清液，待测。

1.5.2GC-MS条件HP-5MS色谱柱（5%苯甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，30m×0.25mm，0.25μm）；载气为氦气，体积流量1mL/min；离子源为EI源，电离能量70eV，离子源温度℃；进样口温度℃，进样体积1μL，采取分流进样方式进行分析。具体检测条件见表2。

按照文献的分类方法[5]将各挥发油的成分按照骨架特征和官能团的不同进行分类，分为9大类，即单萜类化合物、单萜氧化物、倍半萜类化合物、倍半萜氧化物、二萜及其氧化物、脂肪族及脂肪酸类化合物、芳香族类化合物、单萜与芳香族复合结构、倍半萜与芳香族复合结构，然后统计各成分分类的百分比含量。

1.6皮肤电阻动力学技术评价“四气”药性对辛味中药挥发油促渗能力

参照文献报道[6]采用皮肤电阻动力学技术测定透皮促渗能力。取一定量的挥发油，精密称定，用异丙醇-PBS（7∶3）稀释成3%的挥发油溶液。大鼠皮肤解冻，在PBS中水合1h，固定于嵌套上，角质层朝上，放入24孔板中，接收室加入μLPBS，供给室先加入μL异丙醇-PBS（7∶3），平衡2min，读取电阻值，记为初始电阻（R0），随后将异丙醇-PBS（7∶3）去除，加入μL3%挥发油溶液，于不同时间点读取电阻值，记为Rt。将R0/Rt对时间t绘制曲线，以曲线斜率、与空白溶剂组斜率比（ER）作为评价参数。

2结果与分析

2.1挥发油成分与透皮促渗能力分析

透皮促渗实验结果见表3。挥发油的斜率越大、ER越大，说明透皮促渗能力越强。丁香油的促渗能力最小，高良姜油和肉桂油促渗能力较强，大部分挥发油ER在6左右。GC-MS分析的20种中药挥发油的成分类型及比例见表4，可见以萜类成分为主。

2.2数学模型建立

为了分析药性的影响因素，将药性的温、寒、热作为响应取值，将促渗能力（u）、单萜类化合物（x1）、单萜氧化物（x2）、倍半萜类化合物（x3）、倍半萜氧化物（x4）、二萜及其氧化物（x5）、脂肪族及脂肪酸类化合物（x6）、芳香族类化合物（x7）、单萜与芳香族复合结构（x8）作为9个因子。

当影响某一指标的变量较多时，若不加选择，通过回归建立判别函数，一是计算量相当大，二是忽略变量间的相关性，导致求解不稳定，计算精度下降，有选择地筛选变量就很重要，也有价值和意义，本实验以贝叶斯判别函数为判别准则，按照变量的重要性，采用“有进有出”的算法，逐步引入新变量，通过二项式逐步判别法剔除不重要的旧变量，直到最后的判别函数中所有变量都重要，将9个因子两两交叉相乘形成二次判别函数的变量，共45个，如uu=u×u；uxi=u×xi；xxij=xi×xj,(1≤i≤j≤8)。

2.3分析结果

2.3.1温和寒的对照判别

（1）线性判别：通过逐步选择可得，重要性顺序是u、x3、x6、x5、x8、x2；实际上只需u、x3、x63个变量，通过3个变量的取值回代到判别函数中就能判别挥发油的药性，正确率%。判别函数为f=58.32－10.38u＋0.38x＋0.14x6。判别函数值越大，越趋于寒性。可见促渗能力越大越趋于温性，促渗能力越小越趋于寒性；倍半萜类化合物、脂肪族及脂肪酸类化合物含量越大越趋于寒性，倍半萜类化合物、脂肪族及脂肪酸类化合物含量越小越趋于温性。

（2）二项式判别：考虑成分间存在交互作用，可能几个药综合起来影响药性。于是考虑两两交互作用，为此引入二项式逐步判别，逐步判别法依次选出重要性顺序是xx37、xx66、xx26、xx47、xx35、ux2、xx27实际上只需xx37、xx个变量，回代就能%正确。判别函数为f=?8.＋0.xx36＋0.xx66。判别函数值越大，越趋于寒性。可见；同时倍半萜类化合物与芳香族类化合物含量越多，以及脂肪族及脂肪酸类化合物相互作用越大，越趋于寒性，含量越小越趋于温性。

2.3.2热和温的对照

（1）线性判别：通过线性判别函数发现变量重要性顺序是x3、u、x4。实际上只要取是x3、u即可%准确判别。判别函数是f(x)=?11.＋1.u＋0.x3，f(x)＞0判为热，f(x)＜0判为温。说明倍半萜类化合物含量越高，药性越趋于热，促渗能力越高。

（2）二次判别：通过二次多项式判别法得到重要性依次是ux3、xx33、xx13、xx16、x1、xx78，实际上只要ux3、xx个变量，回代就可以%正确。判别函数是f(x)=?16.＋0.ux3－0.xx33，f(x)＞0，判为热，否则为温。可见促渗能力与倍半萜类化合物越大越判为热，否则判为温；xx33越大越判为温，否则判为热。

2.3.3寒热温综合分析

（1）线性逐步判别：影响药性的重要因子依次是x3、x4、x8、x1、u、x6、x5x7x2。仅考虑x3、x4、x8、x1、u、x6、x5由于样本量较大，只有用上7个变量才能较好分析。倍半萜类化合物、倍半萜氧化物、单萜与芳香族复合结构、单萜类化合物、脂肪族及脂肪酸类化合物、二萜及其氧化物，各个成分的含量不一样，导致药性不一样，反过来得到，单萜氧化物和芳香族类化合物的含量多少对寒热温药性的影响不显著。

判别函数是F1=?3.－0.x1＋0.x3＋0.x4－0.u＋1.x8＋0.x6－0.x5，F2=?10.－0.x1＋0.x3－0.x4＋0.u＋0.x8－0.x6＋0.x5。F1、F2都小于0最大时判为温；F1＞0＞F2时判为寒；F2＞0＞F1时判为热；F1、F2都大于0最大时判为寒，F1＞F2时判为寒；F2＞F1时判为热。

（2）二次逐步判别：变量重要性依次是：xx13、xx37、xx47、xx23、x67、xx55、xx44，即为单萜类化合物（x1）与倍半萜类化合物（x3）的组合、倍半萜类化合物（x3）与芳香族类化合物（x7）的组合、倍半萜氧化物（x4）与芳香族类化合物（x7）的组合、单萜氧化物（x2）与倍半萜类化合物（x3）的组合、脂肪族及脂肪酸类化合物（x6）与芳香族类化合物（x7）的组合。只要xx13xx37xx47xx23x67xx55的取值代入判别函数中，正确率%。

F1=?.51＋0.25xx13＋0.16xx37＋0.32xx47＋0.19xx23＋0.35xx67－1.23xx55－2.12x3，F2=?.53＋0.38xx13＋0.24xx37＋0.35xx47＋0.28xx23＋0.44xx67－1.55xx55－3.41x3，F3=?0.60＋0.02xx13＋0.01xx37＋0.02xx47＋0.01xx23＋0.02xx67－0.07xx55－0.13x3。对每一个样本计算F1、F2、F3；F1最大时判为寒；F2最大时判为热；F3最大时判为温。

通过以上分析推断，倍半萜类化合物在药性方面起决定作用。在温寒药性配对实验中，倍半萜类化合物含量越大，药性越趋于寒性；在热温药性配对实验中，倍半萜类化合物含量越大，药性越趋于热性；在寒热温一起配对实验中，单萜类化合物与倍半萜类化合物交互作用明显影响药性。

在温寒配对实验中，温性中药挥发油的促渗能力强于寒性中药挥发油；在热温实验中，热性中药挥发油的促渗能力高于温性中药挥发油。

综合发现，挥发油中倍半萜类化合物的含量主要影响其药性中的四气，而挥发油的四气药性决定着其透皮促渗能力。

3讨论

皮肤电阻动力学技术是一种新型的、快速测定PE透皮促渗效果的研究技术，机制研究表明其主要与PE对皮肤角质层脂质的作用直接相关[7]，而皮肤角质层脂质是决定皮肤屏障功能的关键要素[8]。

清代名医吴师机在《理瀹骈文》中提出“膏药热者易效”。本研究结果也证明了热性辛味中药挥发油透皮促渗作用优于温性和寒凉药性，并首次发现倍半萜类成分可能是决定热性中药挥发油透皮促渗能力的关键要素。与挥发油常见的单萜类成分相比较，倍半萜类成分脂溶性更高、挥发性更弱，可能与皮肤角质层脂质的作用能力更强或更易于滞留在角质层中发挥透皮促渗作用，其作用机制还有待进一步研究阐明。值得一提的是，倍半萜类成分如橙花叔醇已被证明是性质优良的PE[9]。

本实验采用逐步判别法、以贝叶斯判别函数为准则，找出最影响药性的重要因子，在模型建立过程中，不仅考虑单个化学成分的线性影响，而且研究了化学成分的交互作用对药性的非线性影响，通过回代验证模型全部正确。

参考文献（略）

来源：杨文国，朱学敏，吴凤烨，董昀菲，溪江安，陈思颖，陈军.基于逐步判别法分析辛味中药挥发油“四气”药性、透皮促渗能力和化学成分的关联因素[J].中草药,,50(17):4-.