蜂蜜经炼制后为炼蜜，一是作为中药炮制中蜜炙法的辅料，能起到增强药物疗效、缓和药性、解毒和矫味矫臭等作用[1]；二是作为传统剂型蜜丸的辅料，在成型工艺起到黏合剂的作用，常用于治疗慢性病方药和滋补剂制丸[2-3]。蜂蜜中富含丰富的糖、有机酸、维生素等营养物质，具有滋补、平喘、缓下、通便、解毒等作用[4]。蜂蜜炼制后化学成分会发生变化，如挥发油总量降低[3]，果糖和葡萄糖量降低，5-羟甲基糠醛量升高[4]。此外，蜂蜜中还含有多种黄酮类成分[5-10]，主要来自蜜源植物的花蜜、花粉和蜂胶，不同蜜源植物的蜂蜜中黄酮类成分的种类和量均存在差异[6]。但炼制对蜂蜜中黄酮类成分的影响还未见报道。蜂蜜中黄酮类成分定量测定常用的提取分离方法主要有液-液萃取法[11]、大孔树脂吸附法[7]、固相萃取法[10]等，目前较为常用的是固相萃取法。常用分析方法主要有HPLC[12]、CZE[13]、LC-MS[14]、LC-NMR[15]等。本实验采用固相萃取法富集蜂蜜中的黄酮类成分，通过UPLC-MS/MS法测定蜂蜜和炼蜜中15种黄酮类成分的量，并对比分析炼制前后黄酮类成分种类和量的变化，为探讨炼制对蜂蜜中黄酮类成分的影响提供依据。

1仪器与材料

Agilent系列高效液相色谱仪，包括GA脱气机，GA四元泵，GA自动进样器，GA恒温箱，HP化学工作站；AgilentAQQQ质谱仪，美国Agilent公司；Strata-X固相萃取小柱，规格mg/3mL，美国Phenomenex公司；旋转蒸发器，上海振捷实验设备有限公司；TCQ-型超声波清洗器，北京医疗设备二厂；SartoriusCPD型十万分之一电子天平，德国赛多利斯公司；WYA-2W型阿贝折光计，上海物理光学仪器厂。

对照品芦丁（批号-，质量分数≥98%）购自中国食品药品检定研究院；对照品芸香柚皮苷（批号MUST-，质量分数≥98%）购自成都曼思特生物科技有限公司；对照品杨梅素（批号DST-，质量分数≥99%）、桑黄素（批号DST-，质量分数≥98%）、山柰酚（批号DST-，质量分数≥98%）、染料木素（批号DST-，质量分数≥98%）、高良姜素（批号DST-，质量分数≥99%）、乔松素（批号DST-，质量分数≥99%）、白杨素（批号DST-，质量分数≥99%）购于成都德思特有限公司；对照品槲皮素（批号-907，质量分数≥98.6%）、木犀草素（批号-504，质量分数≥99%）购自中国食品药品检定研究院；对照品汉黄芩素（批号CAN，质量分数≥98%）购于和光纯叶株式会社；对照品短叶松素（批号T16F8Z，质量分数≥98%）购于上海源叶生物科技有限公司；对照品芹菜素（批号-，质量分数≥99.6%）购于中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；对照品柚皮素（批号k，质量分数≥95%）购于Sigma公司。乙腈、甲醇为色谱纯，均购自美国Fisher公司；盐酸为分析纯，购自北京化工厂；水为超纯水。蜂蜜样品来自市售，共收集6种不同来源的蜂蜜，涉及品种有椴树蜜、洋槐蜜、百花蜜和枣花蜜。样品详细信息见表1。

2方法与结果

2.1炼蜜的制备和水分测定

参考《中药药剂学》“蜜丸”项下蜂蜜的炼制方法[16]，将蜂蜜放入锅中，加热，待温度达到～℃，出现浅黄色有光泽的均匀小泡，呈鱼眼泡状，且用手捻之多有黏性，两手指打开时无长白丝出现，滴水不散时，即成炼蜜。依据《中国药典》年版第四部通则折光率测定法[17]，采用阿贝折射仪测定蜂蜜炼制前后的水分量，结果见表1，均符合药典要求的不得超过24%。

2.2色谱条件与质谱条件

2.2.1色谱条件ThermoAccucoreRP-MS色谱柱（mm×2.1mm，2.6μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱：0～15min，6%～32%甲醇；15～30min，32%～42%甲醇；30～40min，42%甲醇；40～58min，42%～70%甲醇；58～60min，6%甲醇；体积流量0.3mL/min，柱温30℃，进样量5μL。

2.2.2质谱条件正离子检测模式，采用电喷雾电离源（ESI），扫描方式为多反应离子监测模式（MRM），HPLC-TQ-MS图谱见图1，各化合物的质谱信息见表2。

2.3对照品溶液的制备

分别取芦丁、芸香柚皮苷、杨梅素、槲皮素、桑黄素、木犀草素、山柰酚、短叶松素、柚皮素、染料木素、芹菜素、汉黄芩素、高良姜素、乔松素、白杨素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成0.、0.、0.、0.、

0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.mg/mL的溶液，作为对照品储备液。分别精密吸取上述15个对照品储备液适量，混合，加甲醇定容，制成含各成分分别为0.、0.、50.、

6.、6.、2.、17.、1.、1.、0.、0.、0.0、

2.、6.、5.μg/mL的混合对照品溶液。

2.4供试品溶液的制备

参考文献方法[8-9]，分别取各供试品约10g，精密称定，置于mL三角瓶中，加入pH值为2.0的盐酸溶液30mL，振荡提取1h，提取液7r/min离心10min，上清液通过预处理好的Strata-X固相萃取柱（固相萃取柱的预处理：分别加入5mL甲醇和10mLpH值为2.0的盐酸溶液进行活化），以水10mL洗脱，弃去水液，再用甲醇20mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣精密加甲醇2mL超声使溶解，0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5方法学考察

2.5.1线性关系考察和检测限（LOD）、定量限（LOQ）测定精密吸取混合对照品溶液，用色谱甲醇梯度稀释成不同质量浓度的对照品溶液。以待测物质量浓度为横坐标（X），待测物峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。计算LOD和LOQ。结果见表3。

2.5.2精密度试验精密吸取洋槐蜜1炼蜜样品制备的供试品溶液，连续进样6次，测得芦丁、芸香柚皮苷、杨梅素、槲皮素、桑黄素、木犀草素、山柰酚、短叶松素、柚皮素、染料木素、芹菜素、汉黄芩素、高良姜素、乔松素、白杨素峰面积积分值的RSD分别为1.35%、0.56%、0.00%、1.04%、1.05%、

0.30%、1.16%、1.33%、0.60%、0.50%、1.10%、1.36%、0.94%、0.75%、

0.96%，精密度良好。

2.5.3重复性试验取洋槐蜜1炼蜜样品约10g，6份，精密称定，按“2.4”项下方法制备成供试品溶液，分别进样测定，计算各成分质量分数。样品中芦丁、芸香柚皮苷、杨梅素、槲皮素、桑黄素、木犀草素、山柰酚、短叶松素、柚皮素、染料木素、芹菜素、汉黄芩素、高良姜素、乔松素、白杨素的平均质量分数分别为2.60、12.97、0.00、.12、.54、44.59、.54、24.20、

19.87、12.51、1.99、0.97、42.70、.48、88.61ng/g，RSD分别为2.78%、1.95%、0.00%、2.20%、1.80%、1.90%、2.11%、2.19%、2.60%、2.68%、2.36%、2.30%、2.20%、1.93%、2.54%，符合要求。

2.5.4稳定性试验取洋槐蜜1炼蜜样品约10g，精密称定，按“2.4”项下方法制备成供试品溶液，在制备后0、2、4、6、8、10、12、24h进样，测得芦丁、芸香柚皮苷、杨梅素、槲皮素、桑黄素、木犀草素、山柰酚、短叶松素、柚皮素、染料木素、芹菜素、汉黄芩素、高良姜素、乔松素、白杨素峰面积积分值的RSD分别为1.42%、1.55%、0.00%、0.89%、1.31%、1.21%、0.53%、

1.33%、1.02%、1.24%、1.63%、1.35%、0.91%、1.25%、1.66%，符合要求，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.5.5加样回收率试验取洋槐蜜1炼蜜样品约5g，6份，精密称定，分别精密加入各对照品适量（加入约为样品中各成分量一半的对照品），按照“2.4”项下方法制备成供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，计算回收率，结果芦丁、芸香柚皮苷、杨梅素、槲皮素、桑黄素、木犀草素、山柰酚、短叶松素、柚皮素、染料木素、芹菜素、汉黄芩素、高良姜素、乔松素、白杨素的平均加样回收率分别为99.18%、98.69%、99.92%、99.21%、99.56%、99.72%、

99.49%、98.83%、99.24%、98.68%、99.08%、99.14%、99.65%、

99.17%、98.33%，RSD分别为2.05%、1.35%、1.02%、2.70%、2.06%、

2.19%、1.94%、2.86%、1.88%、2.49%、2.49%、2.10%、2.09%、2.32%、

1.91%。

2.6样品测定

分别取蜂蜜和炼蜜样品各10g，按照“2.4”项下方法制备，测定各黄酮类成分量，并考虑水分量，各成分以干燥品计算。具体结果见表4。对比分析炼制前后蜂蜜中黄酮类成分的种类和含量的变化，以及不同蜂蜜中黄酮类成分种类和含量的差异。

3讨论

3.1RRLC-TQ-MS的条件优化

文献报道的蜂蜜中黄酮成分定量测定，采用甲醇-甲酸[5]或乙腈-甲酸[11]作为流动相，实验对比了2种流动相，还对甲酸体积分数进行了考察，结果表明甲醇显现出更好的峰形，而加入到流动相中的甲酸为0.1%的时候，能通过增强分析物的电离而显著提高灵敏度和优化峰形。因此选择0.1%甲酸水溶液-甲醇作为流动相。在质谱条件的优化中，发现15种成分在正离子模式下的响应值均高于负离子模式，因此选取正离子模式，并对所有目标分析物的多反应监测（MRM）模式进行了优化。

3.2不同蜂蜜中黄酮类成分种类和含量

本实验共收集6种不同来源的蜂蜜，涉及品种有椴树蜜、洋槐蜜、百花蜜和枣花蜜，共检测到12种黄酮类成分，包括黄酮苷元、二氢黄酮苷元和异黄酮苷元。黄酮苷元有8种：槲皮素、桑黄素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、汉黄芩素、高良姜素和白杨素；二氢黄酮苷元有3种：短叶松素、柚皮素和乔松素；异黄酮苷元染料木素。不同蜜源蜂蜜所含黄酮类成分的种类有一定的相似性，4种蜜源蜂蜜均含有乔松素、白杨素、槲皮素、桑黄素、木犀草素、山柰酚、短叶松素、柚皮素和高良姜素，但同时也存在一些差异，如洋槐蜜和百花蜜含有染料木素，而椴树蜜和枣花蜜不含。此外，黄酮类成分的量也存在明显差异，其中来自加拿大的百花蜜黄酮类成分量最高；不同蜜源蜂蜜各黄酮类成分占比存在明显差异，如椴树蜜中主要以乔松素、白杨素、山柰酚为主，其次是槲皮素和桑黄素；洋槐蜜主要是以山柰酚为主，其次是乔松素、槲皮素、桑黄素和白杨素，其中染料木素量明显高于其他蜜源，与文献研究结果基本一致[14,19]，在多批次样品检测基础上，染料木素或可作为洋槐蜜的潜在标记物；百花蜜主要以山柰酚为主，其次是白杨素、乔松素和槲皮素，其各黄酮类成分量均明显高于其他蜜源蜂蜜；枣花蜜主要是以山柰酚为主，其次是桑黄素和槲皮素。

所有样品中均未检测到杨梅素，文献报道[20]在意大利、西班牙和葡萄牙产的桉树蜜中均检测到杨梅素，而在其他单花蜜均未检测到，被认定为桉树蜜的标志物。本实验检测的样品中没有桉树蜜，因此未检测到杨梅素。

同一蜜源但不同产地的蜂蜜黄酮类成分量存在明显差异，如1号椴树蜜的黄酮类成分量明显高于2号椴树蜜，1号洋槐蜜的槲皮素、桑黄素和乔松素明显低于2号洋槐蜜，这可能与蜜蜂采蜜时蜜源花的花期有关，文献报道不同采收期刺槐花中的指标性成分刺槐苷和鼠李糖刺槐苷的量明显不同[21]；此外，还可能与蜂蜜产地、气候、加工和贮存条件等有关[22]。

3.3蜂蜜炼制前后黄酮类成分种类和含量变化

6种蜂蜜炼制后，检测到的黄酮类成分种类都有增加，都发现了蜂蜜中没有报道过的芦丁和芸香柚皮苷。12种检测到的蜂蜜黄酮类成分在炼制后其量都有不同程度的变化。从黄酮类成分种类看，炼制后椴树蜜和枣花蜜新增加了芦丁、芸香柚皮苷、染料木素；洋槐蜜和百花蜜新增加了芦丁和芸香柚皮苷。从黄酮类成分量看，椴树蜜的槲皮素、桑黄素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、汉黄芩素、乔松素和白杨素量均有增加，短叶松素和柚皮素和高良姜素量没增加反而还有下降的；洋槐蜜中除芹菜素量增加不明显外，其余均有所增加，尤其是槲皮素和桑黄素增加的较为明显；百花蜜和枣花蜜12种黄酮类成分量均显著增加。蜂蜜抗氧化能力与总黄酮量呈正相关[23]，而文献报道[24]指出蜂蜜炼制后DPPH清除率较炼制之前提高了6.32倍，推测其可能与炼制后黄酮类成分量明显增加相关。

文献报道[25]苦荞麦在焙烤加热后，芦丁量有所升高，推测可能是其中的槲皮素-3-葡萄糖芸香苷等其他黄酮类成分在酶等作用下转化为芦丁。因此，推测蜂蜜炼制后产生的芦丁和芸香柚皮苷可能也是由其他黄酮类成分在酶和加热等作用下转化的，但具体由哪种成分转化来的，还需要进一步研究。

3.4蜜丸辅料蜂蜜的代替品——果葡糖浆

目前市场有用果葡糖浆代替蜂蜜生产蜜丸[26]，在教科书中也认为其可以代替蜂蜜用于中药丸剂生产[27]。果葡糖浆又被称为人造蜂蜜，是由蔗糖水解或淀粉酶解而成。其理化性质及所含主要成分果糖和葡萄糖量与蜂蜜基本相似且口味接近，但其不含有黄酮类成分。黄酮类成分具有调节细胞色素酶（CYP）活性作用[28]，CYP酶与药物代谢密切相关[29]，同时黄酮类还具有抗氧化[23]等作用。因此，果葡糖浆能否代替蜂蜜生产蜜丸还值得进一步研究。

本实验通过对比6种不同来源蜂蜜炼制前后黄酮类成分种类和量变化，发现蜂蜜炼制后黄酮类成分种类和量明显增加，但其具体原因仍不清楚，有待进一步的研究。

参考文献（略）

来源：王淳，甘嘉荷，宋志前，刘元艳，宁张弛，马新玲，舒一松，刘振丽.蜂蜜炼制前后黄酮类成分种类和含量变化分析[J].中草药,,49(2):-.

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